声明
本文是学习GB-T 19495.4-2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应 PCR 检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
1 范围
GB/T 19495
的本部分规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系检测实时荧光定性聚合
酶链式反应(PCR)
检测方法有关的仪器设备、试剂和材料、检测步骤、质量控制、防污染措施以及方法的
最低检出限。
本部分适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股
颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树等植物转基因筛选检测，也适用于大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、
马铃薯、亚麻、甜菜和木瓜等植物的品系特异性检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求
GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
转基因 transgene
将物种本身具有的或来源于其他物种的功能 DNA
序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行
转录或表达，以便使该物种获得新的品种特征的技术。
3.1.2
实时荧光 PCR real-time polymerase chain
reaction
实时荧光聚合酶链式反应。在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测
整个 PCR 进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
注：荧光信号的强弱直接反映模板数量。
3.1.3
内源基因 endogenous gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。
注：该基因可用于判定物种特异性。
GB/T 19495.4—2018
3.1.4
外源基因 exogenous gene
利用生物工程技术转入的其他生物基因。
注：转入外源基因后，该生物品种表现新的生物学性状。
3.1.5
Ct 值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Alfalfa-Acc:苜蓿乙酰辅酶 a 羧化酶(Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase)
BAR: 磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)
bp:碱基对(base pair)
CP4-EPSPS: 农根菌 CP4
蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Agrobacterium tumefaciens
strain CP4 Product:herbicide tolerant form of
5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase)
CryIA(c): 苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白 CryIA(c) 基 因[Bacillus
thuringiensis(Bt)subsp.
Kurstaki crystal protein IA(c)]
Cry3A: 苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白 Cry3A 基因[Bacillus
thuringiensis(Bt)subsp. Tenebrionis
crystal protein 3A]
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP: 脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)
dCTP: 脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dNTP: 脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
dUTP: 脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)
EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)
EPSPS:5- 莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate
synthase gene)
GAG56: 一种醇溶蛋白基因(one of y-gliadin genes)
GLuA3: 大米谷蛋白基因(rice glutelin gene)
GOX: 草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene)
LAT52: 花粉特异蛋白 LAT52 基因
Lectin:植物凝集素基因
NPT Ⅱ:新霉素-3'-磷酸转移酶基因(neomycin-3'-phosphotransferase gene)
PAT: 草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)
PCR: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
PLD: 磷脂酶 D 家族基因(phospholipase D family gene)
PMI:6- 磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose-isomerase gene)
pCaMV 35S:花椰菜花叶病毒35S 启动子(35S promoter from cauliflower
mosaic virus)
pFMV 35S:玄参花叶病毒35S 启动子(35S promoter from a modified figwort
mosaic virus)
pNOS: 来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(promoter of nopaline
synthase gene from
Agrobacterium tumefaciens)
pSSuAra: 来自拟南芥的小亚基启动子(the small subunit promoter of
Arabidopsis)
GB/T 19495.4—2018
pTA29: 来源于烟草的花蕊特异性 TA29
基因的发育调节启动子(developmentally regulated pro-
moter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum)
pUbi:玉米泛素基因的启动子(promoter of maize Ubiquitin)
SAH7: 类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因(sinapis arabidopsis homolog 7
gene)
SDS: 十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate)
SPS:蔗糖磷酸盐合成酶基因(sucrose phosphate synthase gene)
Taq:DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)
TE: 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠缓冲液(Tris-HCl、EDTA
buffer)
tE9:为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
tg7:谷氨酰胺转移酶7基因(transglutaminase 7gene)
tNOS: 来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline
synthase gene from
Agrobacterium tumefaciens)
tOCS: 章鱼碱合成酶终止子(terminator of octopine synthase)
t35S:花椰菜花叶病毒终止子(Cauliflower mosaic virus 35 teminator)
UDG: 尿嘧啶 DNA- 糖基酶(uracil DNA glycosylase)
UGPase: 马铃薯 UDP- 葡萄糖焦磷酸化酶基因 (UDP-glucose
pyrophosphorylase gene from
Solanum tuberosum)
UNG 酶：尿嘧啶-N- 糖基化酶(uracil-N-glycosylase)
Wx012: 小麦蜡质基因(waxy wheat genes)
zSSⅡb:玉米淀粉合成酶 b 亚基[the endosperm-specific SS(starch
synthase)Ⅱb]
18SrRNA: 真核生物核糖体小亚基18S 基因(18S ribosomal RNA)
4 方法原理
提取样品DNA 后，通过实时荧光 PCR 技术对样品 DNA
进行筛选检测，根据实时荧光PCR 扩增
结果，判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测结果为阳性的样品，或已知为转基因阳性的
样品，如需进一步进行品系鉴定，则对品系特异性片段进行实时荧光PCR
检测，根据结果判定该样品中
含有哪(些)种转基因品系成分。
5 仪器设备和试剂
5.1 仪器设备
5.1.1 实时荧光 PCR 仪。
5.1.2 样品粉碎仪或研磨机。
5.1.3 天平：感量0.01 g。
5.1.4 水浴锅或恒温孵育器。
5.1.5 冷冻离心机。
5.1.6 高压灭菌锅。
5.1.7 涡旋振荡器。
5.1.8 生物安全柜。
5.1.9 pH 计。
5.1.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
5.1.11 微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)。
GB/T 19495.4—2018
5.2 主要试剂
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 GB/T6682
中一级水的规格。
5.2.1 实时荧光 PCR 预混液
为 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、PCR 反应缓冲液、MgCl2(3 mmol/L～7
mmol/L)、dNTPs(含
dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG 酶等混合配制的溶液。
5.2.2 ROX
荧光校正试剂(50×,使用时稀释至1×)。
5.2.3 引物和探针
5.2.3.1 筛选检测引物探针
筛选检测基因的引物和探针参照附录 A 中表 A.1
的序列合成，加超纯水配制成100 μmol/L 储备
液，实时荧光PCR 扩增的引物和探针工作液浓度为10 μmol/L。
5.2.3.2 品系特异性检测引物探针
根据需要检测的转基因植物品系，参照附录 B 中表 B.1
的序列合成引物和探针，加超纯水配制成
100 μmol/L储备液，实时荧光PCR 扩增的引物和探针工作液浓度为10 μmol/L。
6 检测步骤
6.1 取样和制样
按照GB/T 19495.7 中规定的方法执行。
6.2 样品 DNA 的提取与纯化
按照GB/T 19495.3 的方法或采用具有相同效果的植物基因组 DNA
提取试剂盒进行 DNA 提取。
每个样品应制备2个测试样品提取 DNA (提取平行重复)。
6.3 DNA 浓度测定和定量
按照GB/T 19495.3 中规定的方法执行。
6.4 实时荧光 PCR 检测
6.4.1 转基因成分筛选检测基因的选择
对于未知是否为转基因产品的样品，按照表1选用筛选基因进行检测。
表 1 转基因筛选检测基因选用
大豆及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,BAR,PAT,GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4-
EPSPS,tE9
|
玉米及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT
Ⅱ,BAR,PAT,GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4- EPSPS,Cry3A,tCaMV
35S,PMI,CryIA(b),CRYIA(c),pRice-Eactin
|
GB/T 19495.4—2018
表1(续)
油菜及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV
35S,tNOS,NPTⅡ,BAR,PAT,GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4-
EPSPS,pNOS,pSSuAra,pTA29,tCaMV 35S,tE9,tOCS,tg7
|
水稻及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,tNOS,BAR,CryIA(b),CRYIA(c)
|
棉花及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT
Ⅱ,BAR,PAT,CP4-EPSPS,pUbi,tE9,
CryIA(b),CRYIA(c)
|
马铃薯及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPTⅡ,CP4-EPSPS,Cry3A,pNOS
|
亚麻及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPTⅡ
|
甜菜及其加工品
|
内源基因，pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT
Ⅱ,PAT,CP4-EPSPS,CTP2-CP4-EPSPS
|
苜蓿及其加工品
|
内源基因，pFMV 35S,CTP2-CP4-EPSPS,tE9
|
番茄
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPTⅡ,CRYIA(c)
|
苹果
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
菊苣
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,BAR,NPT Ⅱ
|
剪股颖
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,CP4-EPSPS
|
烟草
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
李子
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
甜瓜
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
木瓜
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
小麦
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,CP4-EPSPS
|
茄子
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPTⅡ,CRYIA(c)
|
桉树
|
pCaMV 35S,pFMV 35S,tNOS,NPT Ⅱ
|
6.4.2 实时荧光 PCR 反应体系
实时荧光PCR 反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行重复。
表 2 实时荧光 PCR 检测体系
10×PCR缓冲液
|
10×
|
1×
|
MgCl₂
|
25 mmol/L |
2.5 mmol/L |
dNTP(含dUTP)
|
2.5 mmol/L |
0.2 mmol/L |
UNG酶
|
5 U/μL |
0.075 U/μL |
上游引物
|
10 μmol/L |
见表A.1、表B.1
|
下游引物
|
10 μmol/L |
见表A.1、表B.1
|
探针
|
10 μmol/L |
见表A.1、表B.1
|
Taq酶
|
5 U/μL |
0.05 U/μL |
GB/T 19495.4—2018
表 2 (续)
DNA模板
|
|
50 ng～250 ng |
超纯水
|
|
补足至25μL
|
注1:可选用含有PCR缓冲液、MgCl₂
、dNTP和Taq酶等成分的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行
实时荧光PCR扩增。
注2:ROX荧光试剂仅在具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。
注3:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。
|
6.4.3 实时荧光 PCR 反应程序
实时荧光PCR 反应参数为：50℃/2 min;95℃/10 min;95℃/15s,60℃/60
s,40个循环。
注： 95℃/10 min 的专门适用于化学变构的热启动 Taq
酶。以上参数可根据不同型号实时荧光 PCR 仪和所选
PCR 扩增试剂体系不同作调整。
6.4.4 仪器检测通道的选择
将 PCR 反应管或反应板放入实时荧光PCR 仪后，设置 PCR
反应荧光信号收集条件，应与探针标
记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
6.4.5 实验对照的设立
实验设置如下对照：
—— 阳性对照，为目标转基因植物品系基因组 DNA,
或含有上述片段的质粒标准分子 DNA;
—— 阴性对照，相应的非转基因植物样品 DNA;
——空白对照，设两个， 一是提取 DNA
时设置的提取空白对照(以双蒸水代替样品),二是 PCR 反
应的空白对照(以双蒸水代替 DNA 模板)。
7 结果判定
7.1 质量控制
下述指标有一项不符合者，需重新进行实时荧光PCR 扩增。
——空白对照：内源基因检测Ct 值≥40,外源基因或品系特异性检测 Ct 值≥40;
—— 阴性对照：内源基因检测 Ct 值≤30,转化事件特异性检测 Ct 值≥40;
—— 阳性对照：内源基因检测Ct 值≤30,转化事件特异性检测Ct 值≤35。
7.2 结果判定
测试样品外源基因检测 Ct 值≥40,内源基因检测 Ct
值≤30,则可判定该样品不含所检基因或
品系。
测试样品外源基因检测Ct 值≤35,内源基因检测 Ct
值≤30,判定该样品含有所检基因或品系。
测试样品外源基因检测 Ct 值在35～40,应调整模板浓度，重做实时荧光 PCR。
再次扩增后的外源 基因检测Ct
值仍在35～40,则可判定为该样品含有所检基因或品系。再次扩增后的外源基因检测
Ct
值≥40,则可判定为该样品不含所检基因或品系。
GB/T 19495.4—2018
8 结果表述
结果为阳性的，表述为"检出×××外源基因"或"检出×××转基因品系"。
结果为阴性的，表述为"未检出×××外源基因"或"未检出×××转基因品系"。
对于核酸无法有效提取的样品，检测结果为"未检出核酸成分"。
9 防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403 和 GB/T19495.2
中的规定执行。
10 最低检出限
各基因片段的实时荧光 PCR 扩增的最低检出限(LOD) 为0 . 01%。
GB/T 19495.4—2018
附 录 A
(资料性附录)
转基因成分筛选检测实时荧光 PCR 引物和探针
转基因成分筛选检测用引物探针序列见表 A.1。
表 A.1 转基因成分筛选检测实时荧光 PCR
引物和探针序列信息表
1
|
18S rDNA |
F
|
eetgagaaacggctacca
|
400
|
65
|
植物内源基因
|
R
|
cgtgtcaggattgggtaat
|
400
|
P
|
FAM-tgcgcgcctgctgccttcct-BHQ1
|
200
|
2
|
HMGI/Y
|
F
|
ggtcgtcctcctaaggcgaaag
|
400
|
99
|
油菜内源基因
|
R
|
cttetteggcggtcgtccac
|
400
|
P
|
FAM-cggagccactcggtgccgcaactt-BHQ1
|
200
|
3
|
CruA
|
F
|
ggccagggtttecgtgat
|
200
|
101
|
R
|
ccgtegttgtagaaccattgg
|
200
|
P
|
FAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca-BHQ1
|
200
|
4
|
adh1
|
F
|
cgtegtttcccatctcttectcc
|
300
|
135
|
玉米内源基因
|
R
|
ccactecgagaccctcagtc
|
300
|
P
|
FAM-aatcagggctcattttctcgctcctca-BHQ1
|
200
|
5
|
zSSⅡ b
|
F
|
cteccaatectttgacatctgc
|
500
|
151
|
R
|
tcgatttctctcttggtgacagg
|
500
|
P
|
FAM-agcaaagtcagagcgctgcaatgca-TAMRA
|
200
|
6
|
Lectin
|
F
|
cctectcgggaaagttacaa
|
150
|
74
|
大豆内源基因
|
R
|
gggcatagaaggtgaagtt
|
150
|
P
|
FAM-ccctcgtctettggtcgcgccctct-BHQ1
|
50
|
7
|
Lectin-KVM
|
F
|
cacctttctegcaccaattgaca
|
200
|
104
|
R
|
tcaaactcaacagcgacgac
|
200
|
P
|
FAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg-BHQ1
|
200
|
8
|
LAT52
|
F
|
agaccacgagaacgatatttgc
|
400
|
92
|
番茄内源基因
|
R
|
ttettgectttteatatecagaca
|
400
|
P
|
FAM-ctctttgcagtcctccettgggct-BHQ1
|
200
|
9
|
SPS
|
F
|
cacctttctcgcaccaattgaca
|
200
|
104
|
水稻内源基因
|
R
|
tcaaactcaacagcgacgac
|
200
|
P
|
FAM-tecgagcegtecgtgcgte-BHQ1
|
200
|
GB/T 19495.4—2018
表 A.1 ( 续 )
10
|
PLD
|
F
|
tggtgagcgttttgcagtct
|
200
|
64
|
水稻内源基因
|
R
|
ctgatccactagcaggaggtcc
|
200
|
P
|
FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg-BHQ1
|
200
|
11
|
GOS
|
F
|
tggtgagcgttttgcagtct
|
200
|
67
|
R
|
ctgatccactagcaggaggtec
|
200
|
P
|
FAM-tgttgtgctgccaatgtggectg-BHQ1
|
200
|
12
|
UGPase
|
F
|
ggacatgtgaagagacggagc
|
400
|
88
|
马铃薯内源基因
|
R
|
cctacctctacecctecgc
|
400
|
P
|
FAM-ctaccaccattacctcgcacctcctca-BHQ1
|
200
|
13
|
SAH7
|
F
|
agtttgtaggttttgatgttacattgag
|
350
|
115
|
棉花内源基因
|
R
|
gcatctttgaaccgcctactg
|
250
|
P
|
FAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt-BHQ1
|
175
|
14
|
GLuA3
|
F
|
gacctccatattactgaaaggaag
|
150
|
121
|
甜菜内源基因
|
R
|
gagtaattgctccatcctgttca
|
150
|
P
|
FAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgctc-BHQ1
|
100
|
15
|
GAG56
|
F
|
caacaattttctcageeccaaca
|
200
|
121
|
小麦属内源基因
|
R
|
tcttgcatgggttcacctgtt
|
200
|
P
|
FAM-tteccgcagccccaacaaccgc-BHQ1
|
200
|
16
|
Wx012
|
F
|
gtcgcgggaacagaggtgt
|
500
|
102
|
小麦种内源基因
|
R
|
ggtgttectccattgcgaaa
|
500
|
P
|
FAM-caaggcggccgaaataagttgcc-BHQ1
|
200
|
17
|
Alfalfa-Acc
|
F
|
gatcagtgaacttcgcaaagtac
|
400
|
90
|
苜蓿内源基因
|
R
|
caacgacgtgaacactacaac
|
400
|
P
|
FAM-tgaatgctectgtgatctgeccatgc-TAMRA
|
200
|
18
|
CHY
|
F
|
ccatgcggatectccca
|
500
|
74
|
木瓜内源基因
|
R
|
catcgtagccattgtaacactagctaa
|
500
|
P
|
FAM-tteecttcatecattcecactcttgaga-BHQ1
|
200
|
19
|
pCaMV 35S
|
F
|
gectctgccgacagiggt
|
100
|
82
|
转基因大豆、玉 米、油菜、棉花、 水稻、番茄、马 铃薯、番木瓜等
外源筛选基因
|
R
|
aagacgtggttggaacgtcttc
|
100
|
P
|
FAM-caaagatggacceceacccacg-BHQ1
|
100
|
GB/T 19495.4—2018
表 A.1 ( 续 )
20
|
pFMV 35S
|
F
|
cgaagacttaaagttagtgggcatct
|
400
|
79
|
转基因大豆、油 菜、马铃薯、番 茄、玉米、棉花
和苜蓿等筛选
检测
|
R
|
ttttgtctggtecccacaa
|
400
|
P
|
FAM-tgaaagtaatcttgtcaacatcgagcagctgg-BHQ1
|
200
|
21
|
tNOS
|
F
|
atcgttcaaacatttggca
|
400
|
165
|
转基因大豆、玉 米、水稻、油菜、 棉花、小麦、番 茄、马铃薯、番木
瓜等筛选检测
|
R
|
attgcgggactctaatcata
|
400
|
P
|
FAM-catcgcaagaccggcaacagg-BHQ1
|
200
|
22
|
NPT Ⅱ
|
F
|
aggatctcgtcgtgacccat
|
400
|
183
|
转基因油菜、棉 花、玉米、甜菜、 番茄、马铃薯、
番木瓜等筛选
检测
|
R
|
gcacgaggaagcggtca
|
400
|
P
|
FAM-cacccagccggccacagtcgat-BHQ1
|
200
|
23
|
BAR
|
F
|
acaagcacggtcaacttec
|
400
|
175
|
转基因油菜、玉
米、小麦、棉花、
水稻、大豆等筛
选检测
|
R
|
acteggecgtccagtcgta
|
400
|
P
|
FAM-ccgagecgcaggaaccgcaggag-BHQ1
|
200
|
24
|
PAT
|
F
|
gtegacatgtcteccggagag
|
400
|
191
|
转基因油菜、
玉米、棉花、大
豆、甜菜等筛选
检测
|
R
|
gcaaccaaccaagggtatc
|
400
|
P
|
FAM-tggccgcggtttgtgatatcgttaa-BHQ1
|
200
|
25
|
GOX
|
F
|
gtcttcgtgttgctggaaccgtt
|
400
|
121
|
转基因油菜、玉
米、甜菜等筛选
检测
|
R
|
gaactggcaggagcgagagct
|
400
|
P
|
FAM-tgctcacgttctetacactcgcgctcg-BHQ1
|
200
|
26
|
CP4-EPSPS
|
F
|
gcaaatcctctggcctttcc
|
100
|
146
|
转基因油菜、大 豆、玉米、棉花、 马铃薯、甜菜、小
麦等筛选检测
|
R
|
cttgcecgtattgatgacgte
|
100
|
P
|
FAM-tcatgttcggcggtctcgcg-BHQ1
|
200
|
27
|
Cry3A
|
F
|
Tecggttacgaggttctt
|
400
|
86
|
转基因玉米、
马铃薯等筛选
检测
|
R
|
ccatagatttgagcgtectta
|
400
|
P
|
FAM-acctatgctcaagctgccaacaccc-BHQ1
|
200
|
28
|
pNOS
|
F
|
gtgaccttaggcgacttttgaac
|
340
|
79
|
转基因油菜、
马铃薯
|
R
|
cgcgggtttctggagtttaa
|
340
|
P
|
FAM-cgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagc-BHQ1
|
400
|
GB/T 19495.4—2018
表 A.1 ( 续 )
29
|
pSSuAra
|
F
|
ggcctaaggagaggtgtggaga
|
340
|
95
|
转基因油菜、
对拟南芥是
内源基因
|
R
|
ctcatagataacgataagattcatggaatt
|
340
|
P
|
FAM-ccttatcggcttgaaccgctggaataa-BHQ1
|
400
|
30
|
pTA29
|
F
|
gaagctgtgctagagaagatgtttatte
|
340
|
117
|
转基因油菜、
对烟草是内
源基因
|
R
|
gctcgaagtatgcacatttagcaa
|
340
|
P
|
FAM-agtecagccacccaccttatgcaagtc-BHQ1
|
400
|
31
|
pUbi
|
F
|
gagtagataatgecagectgttaaac
|
340
|
76
|
转基因棉花、
对玉米是内
源基因
|
R
|
acgcgacgctgctggtt
|
340
|
P
|
FAM-cgtcgacgagtctaacggacaccaac-BHQ1
|
400
|
32
|
tCaMV 35S
|
F
|
ggggtttcttatatgctcaacacatg
|
340
|
 |
118
|
转基因玉米、
油菜
|
R
|
tcaccagtctctctctacaaatctatcac
|
340
|
P
|
FAM-aaaccctataagaaccctaattcccttatctggga-BHQ1
|
400
|
 |
33
|
tE9
|
F
|
tgagaatgaacaaaaggaccatatca
|
200
|
87
|
转基因玉米、大
豆、油菜、棉花、
对豌豆是内源
基因
|
R
|
tttttattcggttttcgctatcg
|
200
|
P
|
FAM-tcattaactcttetccatccatttecatttcacagt-BHQ1
|
200
|
34
|
tOCS
|
F
|
cggtcaaacctaaaagactgattaca
|
340
|
85
|
转基因油菜
|
R
|
cgcteggtgtcgtagatact
|
340
|
P
|
FAM-tcttattcaaatttcaaaagtgceccaggg-BHQ1
|
400
|
35
|
tg7
|
F
|
atgcaagtttaaattcagaaatatttcaa
|
340
|
97
|
转基因油菜
|
R
|
atgtattacacataatatcgcactcagtct
|
340
|
P
|
FAM-actgattatatcagctggtacattgecgtagatga-BHQ1
|
400
|
36
|
PMI
|
F
|
Cegggtgaatcagcgttt
|
200
|
59
|
转基因玉米
|
R
|
Gecgtggcctttgacagt
|
200
|
P
|
FAM-tgecgccaacgaatcaccgg-BHQ1
|
200
|
37
|
CryIA(b)
|
F
|
cgcgactggatcaggtaca
|
400
|
75
|
转基因大米、玉
米、棉花等外源
筛选基因
|
R
|
tggggaacaggctcacgat
|
400
|
P
|
FAM-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-BHQ1
|
200
|
38
|
CRYI A(c)
|
F
|
cggaaatgcgtattcaattcaac
|
400
|
71
|
任选其 一，
转基因水稻、
玉米、棉花
|
R
|
ttctggactgcgaacaatgg
|
400
|
P
|
FAM-acatgaacagcgccttgaccacagc-BHQ1
|
200
|
39
|
CRYIA(c)
|
F
|
gaccctcacagttttggacattg
|
400
|
93
|
R
|
atttctctggtaagttgggacact
|
400
|
P
|
FAM-teecgaactatgactccagaacctaccctatcc-BHQ1
|
200
|
GB/T 19495.4—2018
表 A.1 ( 续 )
40
|
pRice-Eactin
|
F
|
tcgaggtcattcatatgcttgag
|
340
|
95
|
转基因玉米、
对大米是内
源基因
|
R
|
ttttaactgatgttttcacttttgacc
|
340
|
P
|
FAM-agagagtcgggatagtccaaaataaaacaaaggta-BHQ1
|
400
|
41
|
CTP2-CP4-EPSPS
|
F
|
gggatgacgttaattggctctg
|
375
|
88
|
转基因大豆、玉
米、棉花、苜蓿
|
R
|
ggctgcttgcaccgtgaag
|
375
|
P
|
FAM-cacgccgtggaaacagaagacatgacc-BHQ1
|
150
|
GB/T 19495.4—2018
附 录 B
(资料性附录)
转基因植物品系特异性实时荧光 PCR 检测引物探针
转基因植物品系特异性检测用引物探针序列见表 B.1。
表 B.1 转基因植物品系特异性实时荧光 PCR
检测引物和探针序列信息表
大豆
|
GTS40-3-2
|
F
|
ttcattcaaaataagatcatacatacaggtt
|
150
|
84
|
R
|
ggcatttgtaggagccacctt
|
150
|
P
|
FAM-ccttttccatttggg-MGBNFQ
|
50
|
MON89788
|
F
|
teecgctctagcgcttcaat
|
150
|
139
|
R
|
tcgagcaggacctgcagaa
|
150
|
P
|
FAM-ctgaaggcgggaaacgacaatctg-TAMRA
|
50
|
A2704-12
|
F
|
gcaaaaaagcggttagctect
|
400
|
64
|
R
|
attcaggctgcgcaactgtt
|
400
|
P
|
FAM-cggtectccgategcccttcc-TAMRA
|
200
|
A5547-127
|
F
|
gctatttggtggcattttteca
|
400
|
75
|
R
|
cactgcggccaacttacttct
|
400
|
P
|
FAM-ccgcaatgtcataccgtcatcgttgt-TAMRA
|
200
|
DP305423
|
F
|
cgtgttctctttttggctagc
|
800
|
93
|
R
|
gtgaccaatgaatacataacacaaacta
|
500
|
P
|
FAM-tgacacaaatgattttcatacaaaagtcgaga-TAMRA
|
220
|
DP356043
|
F
|
gtcgaataggctaggtttacgaaaaa
|
750
|
99
|
R
|
tttgatattettggagtagacgagagtgt
|
750
|
P
|
FAM-ctctagagatccgtcaacatggtggagcac-TAMRA
|
200
|
MON87701
|
F
|
cgttteeegcctteagtttaaa
|
600
|
89
|
R
|
tggtgatatgaagatacatgcttagcat
|
600
|
P
|
FAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgcc-TAMRA
|
250
|
CV127
|
F
|
aacagaagtttecgttgagctttaagac
|
400
|
88
|
R
|
cattcgtagctcggatcgtgtac
|
400
|
P
|
FAM-tttggggaagctgtcecatgcec-TAMRA
|
100
|
MON87705
|
F
|
tteccggacatgaagccatttac
|
450
|
86
|
R
|
acaacggtgccttggcccaaag
|
450
|
P
|
FAM-aagagacteagggtgttgttatcactgcgg-TAMRA
|
250
|
GB/T 19495.4—2018
表 B.1 ( 续 )
大豆
|
MON87769
|
F
|
catactcattgctgatccatgtagatt
|
600
|
87
|
R
|
gcaagttgctcgtgaagttttg
|
600
|
P
|
FAM-cccggacatgaagccatttacaattgac-TAMRA
|
200
|
FG72
|
F
|
agatttgatcgggctgcagg
|
400
|
70
|
R
|
gcacgtattgatgaccgcatta
|
400
|
P
|
FAM-aatgtggttcatccgtctt-MGBNFQ
|
200
|
MON87708
|
F
|
tcatactcattgctgatccatgtag
|
300
|
91
|
R
|
agaacaaattaacgaaaagacagaacg
|
300
|
P
|
FAM-teccggactttagctcaaaatgcatgta-TAMRA
|
150
|
玉米
|
GA21
|
F
|
cgttatgctatttgcaactttagaaca
|
150
|
112
|
R
|
gcgatcctcctcgcgtt
|
150
|
P
|
FAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggt-TAMRA
|
50
|
NK603
|
F
|
atgaatgacctcgagtaagcttgttaa
|
150
|
108
|
R
|
aagagataacaggatccactcaaacact
|
150
|
P
|
FAM-tggtaccacgcgacacacttccactc-TAMRA
|
50
|
Bt11
|
F
|
tgtgtggccatttatcatcga
|
200
|
68
|
R
|
cgctcagtggaacgaaaactc
|
200
|
P
|
FAM-ttecatgaccaaaatcecttaacgtgagt-TAMRA
|
150
|
Bt176
|
F
|
ggecgtgaacgagctgtt
|
300
|
82
|
R
|
gggaagaagcctacatgttttctaa
|
300
|
P
|
FAM-agcaaccagatcggccgacacc-TAMRA
|
200
|
MON810
|
F
|
tcgaaggacgaaggactctaacgt
|
300
|
92
|
R
|
gecaccttccttttccactatctt
|
300
|
P
|
FAM-aacatcctttgccattgcccagc-TAMRA
|
180
|
MON863
|
F
|
gtaggatcggaaagcttggtac
|
150
|
70
|
R
|
tgttacggectaaatgctgaact
|
150
|
P
|
FAM-tgaacacccatecgaacaagtagggtca-TAMRA
|
50
|
T25
|
F
|
acaagcgtgtcgtgctccac
|
400
|
102
|
R
|
gacatgatactecttccaccg
|
400
|
P
|
FAM-tcattgagtcgttecgccattgtcg-TAMRA
|
200
|
CBH351
|
F
|
Tgttactagatcgcagatcetct
|
400
|
96
|
R
|
ctagaaggcaattctaattgatc
|
400
|
P
|
FAM-gtcgacctgcaggcatgcaaggaattccatt-TAMRA
|
200
|
GB/T 19495.4—2018
表 B.1 ( 续 )
玉米
|
TC1507
|
F
|
tagtettcggccagaatgg
|
300
|
58
|
R
|
ctttgccaagatcaagcg
|
300
|
P
|
FAM-taactcaaggccctcactccg-TAMRA
|
150
|
59122
|
F
|
gggataagcaagtaaaagcgctc
|
250
|
86
|
R
|
ccttaattctecgctcatgatcag
|
250
|
P
|
FAM-tttaaactgaaggcgggaaacgacaa-TAMRA
|
200
|
MIR604
|
F
|
gcgcacgcaattcaacag
|
600
|
76
|
R
|
ggtcataacgtgacteecttaattct
|
300
|
P
|
FAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-TAMRA
|
200
|
3272
|
F
|
tcatcagaccagattctcttttatgg
|
50
|
95
|
R
|
cgtttcccgccttcagttta
|
900
|
P
|
FAM-actgctgacgcggccaaacactg-TAMRA
|
200
|
LY038
|
F
|
tgggttcagtetgcgaatgtt
|
150
|
111
|
R
|
aggaattcgatatcaagcttatcga
|
150
|
P
|
FAM-cgagcggagtttatgggtcgacgg-TAMRA
|
50
|
MON89034
|
F
|
ttetccatattgaccatcatactcatt
|
450
|
77
|
R
|
cggtatctataataccgtggtttttaaa
|
450
|
P
|
FAM-ateeccggaaattatgtt-MGBNFQ
|
100
|
MON88017
|
F
|
gagcaggacctgcagaagct
|
150
|
95
|
R
|
teeggagttgaccatcca
|
150
|
P
|
FAM-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-TAMRA
|
50
|
98140
|
F
|
gtgtgtatgtctctttgcttggtctt
|
500
|
80
|
R
|
gattgtcgttteecgccttc
|
500
|
P
|
FAM-ctctatcgatccecctctttgatagtttaaact-TAMRA
|
200
|
MIR162
|
F
|
gcgcggtgtcatctatgttactag
|
300
|
92
|
R
|
tgcettatctgttgccttcaga
|
300
|
P
|
FAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgcca-TAMRA
|
150
|
DAS40278
|
F
|
cacgaaccattgagttacaatc
|
350
|
98
|
R
|
tggttcattgtattetggctttg
|
350
|
P
|
FAM-cgtagctaaccttcattgtattccg-TAMRA
|
150
|
MON87460
|
F
|
cacgttgaaggaaaatggattg
|
600
|
82
|
R
|
tcgcgatcctcctcaaagac
|
600
|
P
|
FAM-agggagtatgtagataaattttcaaagcgttagacggc-TAMRA
|
250
|
GB/T 19495.4—2018
表 B.1 ( 续 )
棉花
|
MON531
|
F
|
teccattcgagtttctcacgt
|
150
|
72
|
R
|
aaccaatgccaccccactga
|
150
|
P
|
FAM-ttgtccctccacttcttctc-TAMRA
|
50
|
MON1445
|
F
|
ggagtaagacgattcagatcaaacac
|
150
|
87
|
R
|
atcgacctgcagcccaagct
|
150
|
P
|
FAM-atcagattgtcgttteccgccttcagttt-TAMRA
|
50
|
MON15985
|
F
|
gttactagatcggggatatcc
|
150
|
82
|
R
|
aaggttgctaaatggatggga
|
150
|
P
|
FAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa-TAMRA
|
50
|
MON88913
|
F
|
ggctttggctaccttaagagagte
|
500
|
94
|
R
|
caaattacccattaagtagccaaattac
|
500
|
P
|
FAM-aactatcagtgtttgactacat-MGBNFQ
|
100
|
LLCotton25
|
F
|
cagatttttgtgggattggaatte
|
400
|
79
|
R
|
caaggaactattcaactgag
|
400
|
P
|
FAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc-TAMRA
|
200
|
GHB614
|
F
|
caaatacacttggaacgacttcgt
|
400
|
119
|
R
|
gcaggcatgcaagcttttaaa
|
400
|
P
|
FAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt-TAMRA
|
200
|
281-24-236
|
F
|
ctcattgctgatccatgtagatttc
|
350
|
111
|
R
|
ggacaatgctgggctttgtg
|
450
|
P
|
FAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-TAMRA
|
175
|
3006-210-23
|
F
|
aaatattaacaatgcattgagtatgatg
|
400
|
90
|
R
|
actctttctttttctccatattgacc
|
400
|
P
|
FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg-TAMRA
|
150
|
T304-40
|
F
|
agcgcgcaaactaggataaatt
|
400
|
78
|
R
|
cctagatcttgggataacttgaaaaga
|
400
|
P
|
FAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc-TAMRA
|
200
|
GBH119
|
F
|
ccagtactaaaatccagatcatgca
|
400
|
90
|
R
|
gaaattgcgtgactcaaattcc
|
400
|
P
|
FAM-cctgcaggtegacggccgagtac-TAMRA
|
200
|
水稻
|
TT51-1(Bt63)
|
F
|
agagactggtgatttcagcggg
|
400
|
119
|
R
|
gcgtccagaaggaaaaggaata
|
400
|
P
|
FAM-atctgecccagcactcgtccg-TAMRA
|
200
|
GB/T 19495.4—2018
表 B.1 ( 续 )
水稻
|
LLRice62
|
F
|
agctggcgtaatagcgaagagg
|
400
|
88
|
R
|
tgctaacgggtgcatcgtcta
|
400
|
P
|
FAM-cgcaccgattatttatacttttagtccacct-TAMRA
|
200
|
LLRice601
|
F
|
tctaggatecgaagcagatcgt
|
400
|
68
|
R
|
ggagggcgcggagtgt
|
400
|
P
|
FAM-ccacctcceaacaataaaagcgcctg-TAMRA
|
200
|
114-7-2
|
F
|
ccgacgcggaggaagac
|
400
|
69
|
R
|
cgttteecgecttcagttta
|
400
|
P
|
FAM-cggaggcggcgtcaaacactg-TAMRA
|
200
|
Kefeng 6
|
F
|
gcttggatcagattgtcgttt
|
400
|
154
|
R
|
gtcagataaactgattggtctgat
|
400
|
P
|
FAM-cgacaaaagatcaggatttggg-ECLIPSE
|
200
|
Kefeng 8
|
F
|
atattetgaagtggectgtt
|
400
|
171
|
R
|
cgaccatgatgctgttctgc
|
400
|
P
|
FAM-cgttatttatgagatgggtgatctcacccatgcttg-TAMRA
|
200
|
KMD1
|
F
|
tcegcaatgtgttattaagttgtctaa
|
300
|
78
|
R
|
ccgatatgectgcccatct
|
900
|
P
|
FAM-cgteaatttgtttacaccacaatatatcccg-TAMRA
|
100
|
油菜
|
GT73(RT73)
|
F
|
ccatattgaccatcatactcattgct
|
150
|
108
|
R
|
gcttatacgaaggcaagaaaagga
|
150
|
P
|
FAM-ttcecggacatgaagatcatcctcctt-TAMRA
|
50
|
MS8
|
F
|
gttagaaaaagtaaacaattaatatagccgg
|
400
|
130
|
R
|
ggagggtgtttttggttatc
|
400
|
P
|
FAM-aatataatcgacggatccccgggaattc-TAMRA
|
200
|
MS1
|
F
|
acgctgcggacatctacatt
|
400
|
187
|
R
|
ctagatcggaagctgaagatgg
|
400
|
P
|
FAM-ctcattgctgateeacctagecgactt-TAMRA
|
200
|
RF1
|
F
|
ctaagggaggtcaagatgtagc
|
400
|
113
|
R
|
cgggcctaactttiggtgtg
|
400
|
P
|
FAM-ctcatcatcctcacccagtcagcatca-TAMRA
|
200
|
RF2
|
F
|
gggtgagacaatatatcgacg
|
200
|
104
|
R
|
gggcatcgcaccggtgag
|
200
|
P
|
FAM-caccggccaaattcgctcttagccgt-TAMRA
|
200
|
GB/T 19495.4—2018
表 B.1 (续)
油菜
|
RF3
|
F
|
cataaaggaagatggagacttgag
|
400
|
139
|
R
|
agcatttagcatgtaccatcagaca
|
400
|
P
|
FAM-cgcacgcttatcgaccataagccca-TAMRA
|
200
|
Oxy-235
|
F
|
ctaacttttggtgtgatgatgctga
|
400
|
124
|
R
|
cgatagatggtggtgtgagtcttg
|
400
|
P
|
FAM-agctgatggcaagttaatctecccgaagtcg-DABCYL
|
200
|
T45
|
F
|
caatggacacatgaattatgc
|
400
|
123
|
R
|
gactctgtatgaactgttcgc
|
400
|
P
|
FAM-tagaggacctaacagaactcgecgt-TAMRA
|
200
|
Topas19/2
|
F
|
gcggttetgtcagtt
|
400
|
95
|
R
|
cgaccggcgctgatatatga
|
400
|
P
|
FAM-tcccgcgtcatcggcgg-TAMRA
|
200
|
73496
|
F
|
gttettctctteatagctcattacagtttt
|
600
|
84
|
R
|
caaacctccatagagttcaacatcttaa
|
600
|
P
|
FAM-ttagttagatcaggatattcttg-MGBNFQ
|
250
|
MON88302
|
F
|
tecettgaaccttattttatagtgcaca
|
450
|
101
|
R
|
tcagattgtcgtttecegccttca
|
450
|
P
|
FAM-tagtcatcatgttgtaccacttcaaacact-BHQ1
|
200
|
马铃薯
|
EH92-527-1
|
F
|
gtgtcaaaacacaatttacagca
|
300
|
134
|
R
|
teecttaatttctcegctcatga
|
300
|
P
|
FAM-agattgtcgttteecgcctteagtt-TAMRA
|
160
|
亚麻
|
Fp967
|
F
|
agcgcgcaaactaggataaa
|
800
|
105
|
R
|
accttecggctcgatgtcta
|
800
|
P
|
FAM-cgcgcgcggtgtcatctatg-BHQ1
|
100
|
甜菜
|
H7-1
|
F
|
tgggatctgggtggctctaact
|
400
|
108
|
R
|
aatgctgctaaatcctgag
|
400
|
P
|
FAM-aaggcgggaaacgacaatct-TAMRA
|
100
|
木瓜
|
Huanong No.1
|
F
|
gacgagtacaaggagacgcc
|
400
|
174
|
R
|
gttgtcactgaagcgggaag
|
400
|
P
|
FAM-tggctgctattgggcgaatcaactac-BHQ1
|
200
|
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